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在使用核酸提取磁珠过程中的一些常见问题分析

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  使用核酸提取磁珠进行DNA、RNA的提取,相比于传统的氯仿异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法,还有较多人对本方法存在一些误区,针对磁珠使用过程中的常见问题进行阐述与分析,为使用者解答疑惑。
 
  误区一:核酸提取磁珠使用的越多,提取效果越好
 
  核酸提取磁珠的主要特点是既可以分散于液体中,也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离,任何试剂体系,磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的,超过一定的比例,过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中,而丧失其分散的特性,也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质,对于除杂的效果影响非常大。甚***有些时候,过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分,导致整个试剂盒效率低下。有很多时候,在提取效果不佳的时候,减少磁珠使用量,反而是提升提取效果的***优途径。
 
  通常情况下,磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的,因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多,但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好,是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。
 
  以GNT-02系列核酸提取磁珠为例,在提取常量样本(植物组织,全血等)时,通常用量为10ul/次;在提取微量样本(如血清游离DNA,口腔拭子等)时,磁珠用量为15~20ul/次。如需超过这个使用量,需要和技术工程师进行沟通。
 
  误区二:试剂使用的越多,提取效果越好
 
  裂解液是提取过程中的重要成分,裂解效果不好?多加点裂解液。洗涤效果不好?多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。
 
  但是对于磁珠法而言,每增加一部分液体体积,就减少了更多的磁珠碰撞几率,而降低磁珠碰撞几率,会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候,虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,无法保证核酸提取磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的,所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定有效。
 
  对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒而言,一般裂解液使用量不应超过400ul/次,洗涤液使用量不应超过500ul/次。如果确实需要放大体系,磁珠和样本用量也应该相应增加,这种放大不一定是等比例的。
 
  误区三:洗涤次数越多,提取效果越好
 
  提取得到的核酸杂质过多时,使用者会考虑多进行几次洗涤,以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸,且增加了核酸断裂水解的可能性,所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。
 
  GNT系列的试剂盒,单一纯化类试剂盒的洗涤次数为2次,植物、动物类试剂盒的洗涤次数为3次,血液类试剂盒洗涤次数为3~4次。
 
  误区四:样本取用的越多,提取效果越好
 
  在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下,往往核酸提取效果不好,很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。
 
  但简单地增加样本取样量,有时会引入过多的杂质,超出裂解液裂解能力,也会使提取效率降低,所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。
 
  如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低,建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的性,使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。

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