与传统的核酸纯化方法相比,以Fe3O4磁性微球为载体的核酸提取方法已成为现在的主流方式,并且已发展出了全自动化核酸提取工作站,展现了方便快捷性。磁性微球在核酸纯化过程中不需要离心,避免了交叉污染,并且提取结果的重复性好、操作简单。
羟基磁珠由两部分组成:一是磁性的Fe3O4微球,作为内核,具有超顺磁性,能够在外部磁场(磁力架或磁棒)的作用下产生磁性而吸附住。二是二氧化硅包覆层,二氧化硅具备良好的生物安全性及化学稳定性,表面具有大量硅羟基官能团,能够在不同的pH值及离子强度条件下与核酸进行吸附或脱附过程,从而实现核酸的分离纯化。
羟基磁珠能够应用在核酸提取中需要满足以下几点:
1. 在磁场下能迅速聚集,撤去磁场后能均匀分散;
2. 具有合适的尺寸,能够保证其有足够的磁性又不容易沉降;
3. 具有丰富的硅羟基,能够和核酸进行脱附及吸附。
那么,问题来了,面对市面上均称为“硅羟基磁珠”的产品,如何选择?
答案只有一个:材料的结构决定了性能!
什么意思?核酸提取磁珠的性能可以从最新发布的行标《核酸提取试剂盒(磁珠法)YY/T 1717-2020》体现,由以下几个参数决定:提取产量、核酸纯度、提取效率及批内精密度。而这些参数是受硅羟基磁珠的结构影响。
硅羟基的合成分为两步,第一步是合成磁性氧化铁内核,第二步是包覆二氧化硅层。先看第一步磁性氧化铁内核的合成方法,目前的主要合成方法有如下:溶胶-凝胶法,共沉淀法,水热法和高温有机相热分解法。
溶胶-凝胶法是利用凝胶的凝结和聚合,从而形成一个三维网络结构,在热处理之后,凝胶会转变为结晶态。体系的pH值,温度,铁前驱体的浓度和溶剂的特点均会对形成的颗粒尺寸造成影响。
溶剂-凝胶法的特点是反应条件温和,比较容易控制晶体的生长,但是缺点是颗粒的尺寸分布比较宽和结晶性较差,导致其应用受到限制。共沉淀法是采用调整Fe2+和Fe3+的化学计量比,控制溶液的pH值,将生成氧化铁颗粒沉淀。
该方法在工业上应用较广泛,因为其所使用的反应物和反应设备均可大规模的应用,无需严格的反应的条件,简便易操作,无危险性。
但是该方法制备的氧化铁纳米颗粒尺寸不易控制、颗粒粒径分布较宽及结晶性较差,从而导致其物理化学性质受到影响。水热法采用高温高压(>200℃)的反应釜,以水为溶剂来制备纳米颗粒。高温高压条件下会发生很快的纳米颗粒成核与生长过程,在此合成过程中,通过调节反应的时间、反应温度和反应物的浓度可以优化合成的颗粒的尺寸、形貌。
该法合成的颗粒具有尺寸分布窄、结晶性好的特点,并且反应过程较为简单。但是水热法也存在以下缺点:耗时较长,水热釜易损坏等。而高温有机相热分解法因其制备的纳米颗粒具有结晶度高、尺寸分布窄以及单分散性良好的特点被广泛采用。
高温有机相热分解法合成纳米晶体是以高沸点有机溶剂作为反应介质,在高温条件下分解铁前驱体来制备。但往往合成的颗粒尺寸较小,在纳米级,磁相应较弱,表面为疏水性分子,不能分散在水溶液中,并且受限于反应条件苛刻,并未能在工业化实现大批量生产。
简而言之,目前大部分产品采用的合成方式为共沉淀法及水热法。
再看第二步,二氧化硅包覆过程,原理就是将合成的氧化铁微球分散在水中,通过调节溶液的ph值,实现硅烷在水溶液中的水解及聚集,从而在氧化铁微球表面包覆一层二氧化硅。
说了这么多,那究竟从什么参数可以反映出硅羟基磁珠性能的好坏?
根据以上,我们可以得出结论:
1. 结晶性良好的氧化铁微球具有较高的磁性,能快速对磁场作出反应,提高核酸提取速度;
2. 颗粒均匀的微球能保证在使用中核酸提取结果一致,保证批间差较小;
3. 分散性好的磁珠能在核酸提取过程中保证充分与核酸接触,提高核酸产量。